摘要：观察自体DC/CIK细胞联合肝动脉化疗栓塞术(TACE)在中晚期肝癌治疗中的临床疗效。方法：60例中晚期肝癌患者随机分为联合治疗组和单纯TACE组，联合治疗组采用自体DC/CIK细胞联合TACE治疗(n=32)，单纯TACE组采用单纯TACE治疗(n=28)，观察两组治疗前后肿瘤大小、甲胎蛋白(AFP)、生存率、中位生存期、生活质量有无差异。结果：(1)经过治疗，联合治疗组有效率87.50%，单纯TACE组有效率64.29%，差异有统计学意义(P0.05);(2)经过治疗两组血清AFP均下降，但差异无统计学意义(P0.05);(3)联合治疗组治疗0.5年生存率96.88%，1年生存率84.38%，2年生存率65.63%，中位生存期21个月;单纯TACE组治疗后0.5年生存率92.85%，1年生存率64.29%，2年生存率42.86%，中位生存期17个月，差异无统计学意义(P0.05);(4)治疗后联合治疗组生活质量明显提高，差异有统计学意义(P0.05)。结论：DC/CIK联合TACE治疗能够控制肿瘤大小、降低AFP，延长中晚期肝癌患者的生存时间，提高患者的生存率，特别是改善患者生活质量，是中晚期肝癌行之有效的治疗方法，值得临床进一步推广。
正文：
到目前为止，肝癌的首选治疗仍是手术切除。但是由于早期发现困难，一经发现，大多是中晚期病例，手术切除率低。经导管肝动脉化疗栓塞术(transcatheterarterialchemoembolization，TACE)为主的综合治疗是目前公认的治疗不可切除性中晚期肝癌的重要手段，在抑制肿瘤生长、提高患者生存率等方面取得明显进展，并成为二期手术前的有效措施。DC/CIK细胞肿瘤生物治疗，是利用树突状细胞(dendriticcells，DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK)两种细胞联合治疗肿瘤，不仅能激发、增强肿瘤患者特异性抗肿瘤免疫应答，有效清除体内残留病灶，且可在患者体内诱发免疫记忆，从而获得长期的抗瘤效应，因而能够防治常规治疗(手术、化疗和放疗)后肿瘤残留病灶导致的复发和转移[1]，是一种全新、特异、有效的治疗手段。体外实验研究表明，DC联合CIK细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，能“瞄准”肿瘤细胞进行杀伤，且不伤及“无辜”，两者在抗肿瘤细胞中有一定的互补作用，联合应用将取得“1+12”的疗效。临床研究表明，DC/CIK治疗联合化疗、分子靶向药物治疗可以提高非小细胞肺癌[2-4]、原发性肝癌[5]、多发性骨髓瘤等[6]的治疗有效率，改善患者生活质量，延长生存期。本研究通过观察自体DC/CIK细胞联合TACE治疗疗效、生存率及生活质量分析，探讨DC/CIK联合TACE治疗在中晚期肝癌患者治疗中的意义。
1对象与方法
1.1研究对医院肿瘤科年1-10月间入院临床资料完整的60例中晚期肝癌患者，随机分为2个组，其中32例行DC/CIK+TACE治疗(联合治疗组)，28例行TACE治疗(单纯TACE组)。所有病例均经临床、B超、CT或腹部MRI、AFP及病理检查确诊为原发性肝癌，且均无手术指征。所有患者KPS评分60分，预计生存期3个月，心、肝、肾功能基本正常，无自身免疫性疾病。所有患者或法定代理人知情并签署知情同意书，并报医学伦理委员会批准。其中联合治疗组32例，其中男30例，女2例，年龄33～71岁，中位年龄56岁，病理类型：巨块型28例，结节型4例，血AFP阳性29例，阴性3例;单纯TACE组28例，其中男27例，女1例，年龄35～69岁，中位年龄57岁，病理类型：巨块型25例，结节型3例，血AFP阳性24例，阴性4例。两组临床资料经t检验、卡方检验显示无统计学差异，具有可比性(P0.05)。
1.2实验方法
1.2.1TACE治疗所有患者均在美国通用GEADVANTXLC/LPDLX双C臂数字减影血管造影机上进行。采用Seldinger技术经股动脉穿刺，将4.5FYashiro导管插入腹腔动脉或肝总动脉造影，明确病变的部位、范围、供血动脉等情况，随后将导管超选择插入肝固有动脉或肝叶动脉，行动脉灌注化疗，化疗方案为：多柔比星40～50mg或吡柔比星40～50mg+DDP60～80mg或L-OHP～mg，然后把碘油和化疗药混合制成的乳剂行远侧栓塞，碘油的用量依肿瘤大小而定，一般用5～20mL，此时导管应尽可能插入靶血管内，然后退导管头端，注入适量的明胶海绵行近侧栓塞。2组病例共进行人次介入治疗，平均1.7次/例。
1.2.2DC/CIK治疗联合治疗组行TACE治疗前采集患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，进行体外培养，TACE结束后进行DC、CIK细胞回输，共回输4次DC，4次CIK。32例联合治疗组病例均完成至少1个疗程的生物免疫治疗，共计例次。DC/CIK的制备过程：(1)细胞分离：经CS-血细胞分离机分别采集患者的外周血5L中的新鲜抗凝PBMC，再用聚蔗糖(Ficoll)(中国科学院生物物理研究所)分离后经Hank′s液洗3次，收集纯度在90%以上的PBMC;(2)CIK细胞体外培养和扩增：PBMC调整浓度为1×/L，第1天加入rh-干扰素0U/mL，第2天开始加入抗CD3单抗50μg/mL，IL-1aU/mL，IL-20U/mL，连续培养3d，更换含有上述因子培养液1次，连续培养10～20d。每周2次测定白细胞增殖率和CD3、CD56阳性细胞率，当细胞数扩增达到设计目标，阳性目标细胞达到85%时，进行细胞治疗;(3)DC细胞的体外培养和扩增：将CS-分离得到的PBMC(调整浓度为1×/L)培养2h，弃上清，获得贴壁单核细胞，向每孔加入完全培养基，GM-CSFng/mL，IL-U/mL，培养5d后加入HSP复合物1ng/mL，在培养7d后就可以收集悬浮的DC。每份全血可收获1.2×-2.0×DC，无菌检验合格后，可以按方案给患者治疗。(4)DC和CIK共培养：将致敏过的DC与未经致敏的DC计数后，以DC∶CIK=1：3的比例和CIK细胞混合，用CIK培养液培养产生DC-CIK细胞。DC-CIK共培养物和CIK细胞的增殖性能比较于共培养当日起用台盼蓝拒染法计数，动态观察DC共培养物的表型变化，分别于细胞培养的第9天检测DC表面标记CD40、CD80、HLA-D和第9、14天检测CIK和DC-CIK共培养物表面标记CD3、CD56、CD4、CD8。
1.3疗效评价疗效以肿瘤大小、AFP下降、患者生存率、生活质量来评价。随访2年(随访至年10月31日)。评价指标：治疗前1周和治疗后1、3、6、9、12个月行CT或MRI检查，对比治疗前后肿瘤大小、外周血AFP变化。随访并记录患者的生存时间、临床症状改善，比较两组患者的生存情况及生活质量。
1.4统计学分析数据以SPSS15.0统计软件进行处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，用Kaplan-Meier法分析生存情况，以P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1治疗后肿瘤大小的变化按《常见恶性肿瘤诊治规范》内肝癌疗效评价标准，显效(PR)：肿瘤缩小大于50%;有效(PC)：肿瘤缩小介于25%-50%之间;稳定(NC)：肿瘤缩小小于25%;进展(PD)：肿瘤增大25%以上，并有新病灶出现。2组治疗前后肿瘤大小变化见表1，2组总有效率(PR+PC+NC)差异有统计学意义(P0.05)。
2.2治疗前后外周血中AFP的变化治疗后1～4周内复查，2组治疗前后AFP水平均下降(表2)，联合治疗组下降率较单纯TACE组高，但差异无统计学意义(P0.05)。
2.3生存情况联合治疗组32例患者的0.5年生存率96.88%(31/32)，1年生存率84.38%(27/32)，2年生存率65.63%(21/32)，中位生存期21个月;单纯TACE组28例患者0.5年生存率92.85%(26/28)，1年生存率64.29%(18/28)，2年生存率42.86%(12/28)，中位生存期17个月，联合治疗组的0.5、1、2年生存率及中位生存期均高于单纯TACE组，虽统计学无明显差异(表3，P0.05)，但生存曲线(图1)显示联合治疗组生存概率优于单纯TACE组。
2.4生活质量改善联合治疗组患者腹部疼痛评分下降、食欲增加、肝功能好转，以KPS评分标准计算，提高10分或10分以上者为改善，提高或下降小于10分为稳定，下降10分或10分以上者为恶化，总获益率为改善+稳定，联合治疗组KPS升高明显，生活质量明显提高，差异有统计学意义(P0.05)。见表4。
3讨论
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年近50万人死于肝癌，其中40%发生在我国，属高发肿瘤。其病程短，进展迅速，中位生存期仅3～6个月。肝癌的治疗至今仍以手术切除为首选，但多数患者确诊之时已丧失手术时机，且肝脏对放射线的耐受性比较差、肝癌对化疗不敏感，目前尚无标准治疗方案，分子靶向药物索拉菲尼能延长晚期肝癌的生存，但费用昂贵，不能广泛使用，所以目前非手术治疗仍以肝动脉栓塞化疗为首选，自20世纪80年代在我国广泛开展以来，显著地改善了患者的生活质量，延长了生存期，成为肝癌综合治疗中重要的组成部分。
DC是机体内功能最强的专职抗原递呈细胞，能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，成熟DC能有效地激活初始型T细胞，是机体免疫应答的主要启动者，在免疫应答的诱导中发挥关键作用。CIK是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3MoAb、IL-2、IFN-γ、IL-1a等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，CIK细胞能以不同的机制识别杀伤肿瘤细胞。体内外实验[7-9]表明，DC与CIK细胞共培养后对肿瘤细胞的识别杀伤能力增强，能“瞄准”肿瘤细胞进行杀伤，两者在抗肿瘤作用中有互补作用，是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，它可以直接杀伤肿瘤细胞，清除微小残留病灶，而无化疗、放疗毒副作用，耐受性好，是抗肿瘤治疗的重要手段。
近年来，临床研究表明在非小细胞肺癌[2-4]、肝癌[5]、多发性骨髓瘤[6]、乳腺癌[10]、肾癌等[1]多种恶性肿瘤中联合DC/CIK细胞治疗可以显著地提高疗效，延长肿瘤患者的生存期;在晚期非小细胞肺癌的维持治疗[11]中有潜在益处，且无明显副作用;一项晚期非小细胞肺癌的前瞻性研究[12]表明，常规化疗后联合DC/CIK治疗能使晚期非小细胞肺癌患者受益，且细胞免疫治疗次数增加能显著提高TTP和OS，且由于DC/CIK细胞是诱导、激活的自体细胞，没有放、化疗后明显的毒副反应[13]，易被患者所接受，是继肿瘤手术、放疗、化疗后又一种新的有效的治疗手段。本研究对不能手术切除的肝癌患者采用DC/CIK联合TACE治疗，且与单独行TACE治疗患者进行疗效对比，通过研究发现，联合治疗组在控制肿瘤大小、降低外周血AFP和0.5年、1年及2年生存率、中位生存期等方面均优于单纯TACE治疗，特别是提高患者生活质量方面优势明显，提示DC/CIK联合TACE在提高肿瘤局部控制率、延长生存期、提高生活质量方面均有优势。DC/CIK细胞是通过获取外周血单个核细胞后进行体外增殖、培养，通过静脉直接回输进入血液循环，并对肿瘤细胞进行识别和杀伤，联合TACE可以起到清除体内极微小的瘤灶或体内散在的瘤细胞，起到延缓或阻止肿瘤转移和复发的作用，因此DC/CIK细胞可能是针对肿瘤转移和复发较为有效的治疗方法。其次，肝癌患者免疫功能下降，行TACE治疗后食欲下降、免疫功能进一步下降，生物免疫治疗作为辅助治疗，可有效提高患者的免疫功能、改善生活质量、延长生存期，同时增加化疗的敏感性、降低化疗的副作用。TACE联合DC/CIK较单一TACE治疗有明显优势，且副作用减轻，术后恢复较快，不失为晚期肝癌较为有效的联合治疗方案之一。
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